韩春雨(中)及其合作者沈啸(左)、高峰(右)。本人供图。
2016年5月10日--基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
在CRISPR/Cas9系统中，酶Cas9在DNA靶位点上进行切割，其中这种靶位点是这样确定的：一种被称作CRISPR RNA（crRNA）的RNA分子利用它的一部分序列与另一种被称作tracrRNA的RNA分子通过碱基配对结合在一起，形成嵌合RNA（tracrRNA/crRNA），然后，借助crRNA的另一部分序列与靶DNA位点进行碱基配对，以这种方式，这种嵌合RNA就能够引导Cas9结合到这个靶位点上并进行切割。在实际应用时，人们可以将tracrRNA和crRNA作为两种向导RNA（gRNA）或者融合在一起形成单向导RNA（single guide RNA, sgRNA），并被用来引导酶Cas9结合到靶DNA序列上并进行切割，其中Cas9与sgRNA一起被称作Cas9-sgRNA系统。
进一步的研究还证实，CRISPR/Cas9的基因组编辑能力只有在被称作前间隔序列邻近基序(protospacer adjacent motif, PAM)的短片段DNA序列的存在下才成为可能。只有DNA靶位点附近存在PAM时，Cas9才能进行准确切割。再者，PAM的存在也是激活酶Cas9所必需的。
尽管科学家们已采用多种方式对CRISPR/Cas9系统进行优化来提高它的效率和特异性，它仍然存在一些不足之处，如CRISPR/Cas9系统仍然会在脱靶位点（在这些位点上，gRNA与靶DNA序列之间存在错配）进行切割，这种脱靶切割有可能导致很多有害的后果，如癌症产生；gRNA容易形成二级结构，等等。
在一项新的研究中，来自中国河北科技大学和浙江大学医学院的研究人员发现类似于Cas9，来自Argonaute蛋白家族的核酸内切酶也利用寡核苷酸作为向导降解入侵的基因组。具体而言，他们发现来自格氏嗜盐碱杆菌（Natronobacterium gregoryi）的一种Argonaute蛋白（NgAgo）作为一种核酸内切酶，在向导DNA（guide DNA, gDNA）的引导下，能够在人细胞中进行基因组编辑。相关研究结果于2016年5月2日在线发表在Nature Biotechnology期刊上，论文标题为“DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute”。论文通信作者为河北科技大学生物科学与工程学院韩春雨（Chunyu Han）副教授。
来自格氏嗜盐碱杆菌的Argonaute蛋白利用单链gDNA切割靶DNA
尽管来自嗜热栖热菌（Thermus thermophilus）的Argonaute蛋白（TtAgo）或来自强烈炽热球菌（Pyrococcus furiosus）的Argonaute蛋白（PfAgo）在5’端发生磷酸化的单链DNA存在下能够在体外切割DNA靶序列，但是它们都需要非常高的反应温度（>65 °C），这就使得它们不能够应用于哺乳动物细胞中。为了解决这一问题，研究人员利用PSI-BLAST搜索工具以TtAgo和PfAgo氨基酸序列为对象，在美国国家生物技术信息中心（NCBI）非冗余蛋白序列数据库中进行搜索，从中鉴定出一种潜在的候选蛋白：来自格氏嗜盐碱杆菌SP2菌株的Argonaute蛋白（即NgAgo）。
研究人员接着设计三种5’端发生磷酸化的长24个核苷酸的单链gDNA，其中两种单链gDNA彼此互补（记为FW和RV），而且能够结合到pACYCDuet-eGFP质粒的靶位点上；第三种单链gDNA含有随机的碱基序列，但不与这种质粒互补（记为NC）。此外，他们还设计了一对5’端发生磷酸化的单链gRNA，它们也能够结合这种相同的靶位点上。结果证实，在没有gDNA存在时，或者在NC gDNA存在时，NgAgo都不能切割这种质粒。当FW或RV gDNA存在时，NgAgo能够在37 °C下让这种超螺旋的质粒产生切口。当FW和RV gDNA同时存在时，NgAgo能够让这种质粒线性化。但是，在5’端未发生磷酸化的单链gDNA或者5’端发生磷酸化的单链gRNA存在下，NgAgo都不能切割这种质粒。
因此，NgAgo当与5’端发生磷酸化的单链gDNA结合时能够在37 °C下切割靶双链DNA。
NgAgo结合单链gDNA，并导致靶DNA发生双链断裂
为了评估NgAgo是否能够作为一种基因组编辑工具进行使用，研究人员首先在293T细胞中表达NgAgo，并研究它是否与人细胞中的内源性核酸结合，结果他们并未检测到与从293T细胞中纯化出来的NgAgo相结合的核酸，这提示着人细胞中存在的5’端发生磷酸化的单链DNA是非常少的，而且即便存在内源性的单链DNA，也不会将NgAgo引导到脱靶位点上。
研究人员利用编码NgAgo的质粒和这些人工合成的长24个核苷酸的单链gDNA或gRNA（5’端发生或未发生磷酸化）转染293T细胞时，发现NgAgo只能结合5’端发生磷酸化的单链gDNA，而不能结合单链gRNA和5’端未发生磷酸化的单链gDNA。
当将编码NgAgo的质粒转染到293T细胞24小时后再将5’端磷酸化的单链gDNA运送到这些细胞中时，研究人员发现NgAgo结合单链gDNA的数量显著下降，这提示着当NgAgo表达时，它只有在较短的时间内装载单链（或者说结合）gDNA。与这相一致的是，当从293T细胞中纯化出来的未装载单链gDNA的NgAgo在37 °C下即便与单链gDNA在体外孵育长达8小时，单链gDNA也不会装载到NgAgo上。再者，单链gDNA在体外只能在比较高的温度（55 °C）下装载到NgAgo上。只有从已进行单链gDNA转染的293T细胞中纯化出来的NgAgo，而不是在37 °C下与单链gDNA（FW gDNA，或者RV gDNA）孵育的NgAgo，才能在体外切割靶DNA。
进一步的实验证实从已进行NC gDNA转染的293T细胞中纯化出来的NgAgo随后在37 °C下即便与FW gDNA在体外孵育8小时也不能切割靶DNA。这些结果表明NgAgo非常忠实于它的初始单链gDNA，不能够在37 °C下进行单链gDNA交换。不过在55 °C下，NgAgo能够交换单链gDNA，即重新装载单链gDNA，但这时，NgAgo不能象37 °C下装载单链gDNA时那样高效地切割靶DNA，这是因为55 °C高温会降低NgAgo的酶活性。此外，在切割靶DNA时，NgAgo会在双链DNA（不是单链DNA）的靶位点内移除几个核苷酸。
研究人员在哺乳动物细胞中比较NgAgo-gDNA系统和Cas9-sgRNA系统的编辑效率，发现NgAgo-gDNA系统让靶基因失活的效率与Cas9-sgRNA系统一样高。利用这种方法，他们还证实对NgAgo而言，单链gDNA的最佳长度是24个核苷酸左右。
广泛的基因组靶向范围和较低的错配耐受性
研究人员测试了NgAgo对人基因组上的内源性靶位点进行编辑的能力。为此，他们对NgAgo进行修饰，将一种核定位信号（nuclear localization signal）附着到它的氨基端上确保NgAgo位于细胞核中。他们设计出5个针对人DYRK1A基因第11外显子的单链gDNA，然后通过T7核酸内切酶I（T7EI）检测和DNA测序，证实这5个gDNA均能引导NgAgo高效地切割靶DNA序列。
研究人员还测试47个靶向作用于8种不同基因的单链gDNA，他们发现这些gDNA的基因组编辑效率（21.3～41.3%）具有可比性，而且也没有观察到NgAgo对具有特定性质的序列具有明显的偏好性。
研究人员还在包括乳腺癌细胞系MCF-7、人骨髓细胞系K562和HeLa细胞系在内的多种哺乳动物细胞系中测试了NgAgo-gDNA系统，结果发现在所有这些细胞系中，NgAgo都能够高效地诱导DYRK1A基因靶位点发生双链断裂。
为了研究单链gDNA与靶DNA序列之间的核苷酸错配对NgAgo活性的影响，研究人员先针对一个DYRK1A基因靶位点设计出一个长24个核苷酸的单链gDNA，然后在这个单链gDNA的每个位置上引入单核苷酸错配。他们发现NgAgo介导的靶DNA切割对这个gDNA每个位置上的单核苷酸错配非常敏感：切割效率下降了73～100%，其中P8～P11位置上发生的单核苷酸错配导致最大的切割效率下降（85~100%）。他们还发现任何3个连续位置发生错配会完全破坏这种切割。
为了研究当单链gDNA长度发生变化时，NgAgo是否仍然对单核苷酸错配敏感，研究人员合成出长21个核苷酸的单链gDNA，结果发现这个长度缩短的gDNA任何位置上发生的单核苷酸错配仍然极大地破坏NgAgo活性；尽管gDNA长度发生变化，P8～P11位置上发生的单核苷酸错配仍然是破坏NgAgo活性最大的关键位置。考虑到Cas9-sgRNA系统甚至能够耐受5个核苷酸错配，这些实验初步地证实NgAgo-gDNA系统是高度保真的。
研究人员比较了NgAgo-gDNA和Cas9-sgRNA系统切割哺乳动物基因组上的DYRK1A基因靶位点的效率，结果发现两者的切割效率是可比的（前者是31.97%，后者是32.2%）。接着，他们还研究了NgAgo-gDNA在靶向切割富含G+C的DNA位点上是否优于Cas9-sgRNA。确实，他们证实相比于NgAgo-gDNA，Cas9-sgRNA切割HBA2基因和GATA4基因上富含G+C DNA位点的效率要差很多。因此，NgAgo-gDNA系统比Cas9- sgRNA有潜力用于更为宽广的基因组位点。再者，Cas9要发挥切割作用，必须要求靶位点紧靠在PAM的上游，而诸如NgAgo之类的Argonaute蛋白则没有这种靶序列限制。
NgAgo准确地将DNA片段插入到基因组中
为了验证NgAgo能够靶向切割哺乳动物基因组，研究人员测试了NgAgo-gDNA系统是否能够被用来编辑基因组。同源重组修复（homology-directed Repair, HDR）介导的供者序列捕获是一种广泛采用的策略，可被用来产生特异性的基因组修饰。为此，研究人员设计出一种由报告基因区和G418抗性基因组成的供者DNA片段，其中这种报告基因区由两个阅读框组成：一个阅读框编码mRFP，另一个是无法阅读的编码eGFP的序列，这两个阅读框由TGA终止子分隔开。这种报告基因区没有启动子，因此正常情形下，不会表达。在将编码NgAgo的质粒、单链gDNA和这种供者DNA片段转染进293T细胞后，研究人员检测到表达mRFP的细胞，并且证实在这些细胞中，供者DNA片段准确地插入到所需的位点中。在进行G418筛选后，他们分离出含有这种供者DNA片段的细胞克隆株。
此外，研究人员还利用NgAgo-gDNA系统靶向切割这种阳性细胞克隆株中的TGA终止子。由非同源性末端连接（nonhomologous end joining, NHEJ）介导的不精准基因组修复让这种TGA终止子发生突变，从而使得mRFP-eGFP嵌合蛋白表达。利用流式细胞仪进行分析，他们检测到11.7%的细胞是eGFP阳性的，这就证实NgAgo-gDNA能够对哺乳动物基因组进行高效地编辑。
最后，当利用Cas9-sgRNA和NgAgo-gDNA系统---其中，Cas9的剂量和NgAgo的剂量相同---分别导入293T细胞中靶向基因组相同位点时，Cas9而不是NgAgo导致供者DNA片段插入到脱靶位点中。
总之，这种NgAgo-gDNA系统设计方便，gDNA可直接转染细胞，而无需构建专门的gDNA表达载体；NgAgo可编辑基因组内任何位点，而Cas9的基因组靶点必须位于PAM序列的上游，而且不能富含G+C；所使用的gDNA是DNA而非RNA，不会像RNA那样容易形成二级结构而导致失效或脱靶效应；对游离于细胞核的DNA具有更高的切割效率。由此可知，相比较于Cas9-sgRNA，NgAgo-gDNA具有更大的优势，规避了令人头痛的脱靶效应，其应用前景是不言而喻的。更难能可贵的是，在Cas9-sgRNA成为全世界各大实验室争相使用的香饽饽时，这项研究发现的新基因编辑系统具有如此巨大的优势，向它发出有力的挑战，也难怪会在国内引发一阵热潮。DNA-guided genome editing using the Natronobacterium gregoryi Argonaute
doi:10.1038/nbt.3547
Feng Gao1, Xiao Z Shen2, Feng Jiang1, Yongqiang Wu1 & Chunyu Han1
The RNA-guided endonuclease Cas9 has made genome editing a widely accessible technique. Similar to Cas9, endonucleases from the Argonaute protein family also use oligonucleotides as guides to degrade invasive genomes. Here we report that the Natronobacterium gregoryi Argonaute (NgAgo) is a DNA-guided endonuclease suitable for genome editing in human cells. NgAgo binds 5′ phosphorylated single-stranded guide DNA (gDNA) of ~24 nucleotides, efficiently creates site-specific DNA doublestrand breaks when loaded with the gDNA. The NgAgo–gDNA system does not require a protospacer-adjacent motif (PAM), as does Cas9, and preliminary characterization suggests a low tolerance to guide–target mismatches and high efficiency in editing (G+C)-rich genomic targets.
