人类的致病遗传变异既有点突变又有碱基插入缺失突变【1】。2016年，哈佛大学David Liu实验室开发出新型单碱基编辑器CBE（Cytosine base editors），实现了C·G--T·A碱基对的自由转换【2】，2017年底他们又构建出ABE（Adenine Base Editor），可实现A·T--G·C碱基对的转换，这对众多点突变遗传病的治疗有重要意义，因而在基因治疗领域的应用前景相当广阔【3】（详见：突破丨Nature长文发表基因编辑最新成果——无需切割DNA也能自由替换ATGC）。不过，除了C·G--T·A和A·T--G·C碱基转换，对其它类型的碱基突变以及碱基的插入缺失突变，目前依然缺乏有效的研究工具：传统的同源重组修复（HDR）需要外源的双链/单链DNA模板，系统复杂且效率低下，这极大地限制了相关工作的开展，因此开发更加高效且广谱的精准基因编辑工具迫在眉睫。
2019年10月21日，哈佛大学David Liu实验室在Nature杂志上发表了题为Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA的论文。文章开发出了全新的精准基因编辑工具PE （Prime Editors），新工具PE无需额外的DNA模板便可有效实现所有12种单碱基的自由转换，而且还能有效实现多碱基的精准插入与删除（最多可插入44bp的碱基，可删除80bp的碱基），这一全能性的工具为基因编辑领域带来了重大变革。
新工具PE是以CRISPR-Cas9系统为基础，在两方面加以改造：首先是改造单链引导RNA（sgRNA），其3’末端增加了一段RNA序列，新获得的RNA被称作pegRNA；第二则是将Cas9切口酶（H840A突变型，只切断含PAM的靶点DNA链）与逆转录酶融合获得新的融合蛋白。pegRNA的3’端序列有双重角色，一段序列作为引物结合位点（PBS），与断裂的靶DNA链3’末端互补以起始逆转录过程，另一端序列则是逆转录的模板（RT模板），其上携带有目标点突变或插入缺失突变以实现精准的基因编辑（图1）。
图1 改造后的pegRNA结构
基因编辑工具PE的基本原理如图2所示，首先是在pegRNA的引导下，Cas9 H840切口酶切断含PAM的靶点DNA链，断裂的靶DNA链与pegRNA的3’末端PBS序列互补并结合，之后逆转录酶发挥功能，沿RT模板序列开始逆转录反应。反应结束后DNA链的切口处会形成处在动态平衡中的5’-和3’-flap结构，其中3’flap结构的DNA链携带有目标突变，而5’flap结构的DNA链则无任何突变。细胞内5’flap结构易被结构特异性内切酶识别并切除，之后经DNA连接和修复后靶位点处便实现了精准的基因编辑。
图2 基因编辑工具PE的基本原理
在经体外验证和酵母中的验证之后，研究者将野生型的鼠白血病病毒（M-MLV）逆转录酶融合在Cas9 H840切口酶的C末端，构建出了第一代精准基因编辑工具PE1，在293T细胞中PE1的点突变效率为0.7~5.5%, 碱基的增加/删除效率则为4~17%，依然有更大的提升空间。之后研究者通过优化M-MLV逆转录酶得到第二代编辑工具PE2，其点突变效率和碱基的增删效率较PE1有两倍以上的提高。
图3 PE3和PE3b的原理图：PE3增加的sgRNA识别位点是未编辑的基因组DNA，PE3b增加的sgRNA只识别编辑后的基因组DNA。
PE1/2系统只编辑双链DNA的一条链，另一条非编辑链需进一步的DNA修复以完成精准编辑。传统上，通过Cas9切口酶切断非编辑链可以有效提高该链的修复效率。为此研究者在PE2的基础上，增加可切断非编辑链的sgRNA，最终获得新的PE3和PE3b系统（图3）。新系统的编辑效率较PE2提升了近3倍，在293T细胞中的最高编辑效率可达78%。当然，由于使用了两条sgRNA，PE3的随机插入缺失（Indels）风险也随之提高，这是PE3未来需要加以改进的不足之处。
研究者对不同的工具进行比较后发现，与单碱基编辑工具CBE、ABE相比，PE3/3b的单碱基编辑在效率上略有不如，但能实现更精准的编辑；而与传统的HDR相比，PE3/3b有着更高的编辑效率和更低的Indels风险。此外，PE3/3b系统在U2OS、K562、HeLa三种细胞系以及小鼠皮层原代神经元中均能发挥精准编辑效果，这表明新系统有着广泛的适用性。
总体而言，本研究开发的新工具PE是精准基因编辑领域的重大突破，在单碱基随意转换和小片段多碱基的增删方面潜力巨大，这将极大的推动生物医学的基础研究和临床基因治疗研究。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-019-1711-4
参考文献
1. Rees, H.A. & Liu, D.R. Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.Nat Rev Genet(2018).
2. Komor AC, Kim YB, Packer MS, Zuris JA, Liu DR. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
3. Gaudelli, N.M. et al. Programmable base editing of A*T to G*C in genomic DNA without DNA cleavage.Nature551, 464-471 (2017).
